本發(fā)明屬于生物分子化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種維生素B12測定試劑盒及其制備方法。本發(fā)明所提供的一種維生素B12測定試劑盒的制備方法，包括：將磁珠與鏈霉親和素反應(yīng)，制備鏈霉親和素包被的磁珠；將檢測抗體偶聯(lián)堿性磷酸酶，制備堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測抗體；然后，采用有機(jī)磷酸酯類化合物對所述堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測抗體進(jìn)行磷酸化修飾，得到酶標(biāo)記抗體復(fù)合物；將經(jīng)過活化處理的生物素偶聯(lián)維生素B12，制備生物素標(biāo)記的維生素B12。通過上述制備方法制得的維生素B12測定試劑盒的穩(wěn)定性顯著提高。