本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，公開了一種多肽偶聯(lián)物與不可逆抑制劑的設(shè)計(jì)方法和檢測方法。所述多肽偶聯(lián)物是含共軛烯酮彈頭的不可逆抑制劑和含有半胱氨酸的多肽的反應(yīng)產(chǎn)物，且所述多肽偶聯(lián)物具有下述結(jié)構(gòu)式X-M-S-CH2-R，其中：X是與目標(biāo)多肽結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的化學(xué)部分，其中，所述目標(biāo)多肽結(jié)合位點(diǎn)含有半胱氨酸殘基；M是由含共軛烯酮的彈頭與所述半胱氨酸殘基的硫原子共價(jià)鍵合形成的修飾部分；S-CH2是所述半胱氨酸殘基的硫-亞甲基側(cè)鏈；和R是所述目標(biāo)多肽的剩余部分。所述設(shè)計(jì)方法包括在候選不可逆抑制劑和目標(biāo)多肽之間形成鍵。所述檢測方法包括在使多肽發(fā)揮酶活性的條件下溫育抑制劑與目標(biāo)多肽。本發(fā)明能用于快速有效地將可逆抑制劑轉(zhuǎn)化成不可逆抑制劑。