本發(fā)明涉及一種L?半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體制備方法，其方法步驟包括：⑴A31V突變體的獲得，以SEQIDNO.2核苷酸序列為模板，SEQIDNO.3、SEQIDNO.4為引物，進(jìn)行PCR得到的突變體基因eamBA31V；⑵將突變體基因eamBA31V與PMW118質(zhì)粒分別用EcorI,XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4連接酶22℃連接12小時，連接產(chǎn)物用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐氯霉素的LB固體平板上，37℃過夜培養(yǎng)；⑶對固體培養(yǎng)基上長出的單菌落用PMW118通用引物M13F、M13R進(jìn)行菌落PCR，將PCR產(chǎn)物測序，驗(yàn)證正確的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒PMW118?eamB?A31V。本發(fā)明同時將L?半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體應(yīng)用于產(chǎn)L?半胱氨酸大腸桿菌工程菌株，可使大腸桿菌對L?半胱氨酸耐受性提高1.78倍，L?半胱氨酸產(chǎn)量提高18％。