本發(fā)明公開了一種單克隆抗體蛋白細(xì)胞培養(yǎng)液澄清的預(yù)處理方法，屬于蛋白質(zhì)純化制備領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

單克隆抗體(monoclonalantibody,mab)是一類重要的生物技術(shù)藥物，在現(xiàn)代生物檢測領(lǐng)域和醫(yī)療領(lǐng)域起著越來越重要的作用?，F(xiàn)有技術(shù)中，單克隆抗體通常由中國倉鼠卵巢細(xì)胞(chinesehamsterovary，cho)表達(dá)產(chǎn)生，隨著上游高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建、基因改造、發(fā)酵條件的不斷優(yōu)化，cho細(xì)胞的單克隆抗體表達(dá)量已經(jīng)達(dá)到30g/l以上，培養(yǎng)規(guī)模也逐步擴(kuò)大，伴隨著生物量以及雜質(zhì)量的顯著提高，上游產(chǎn)能的提升給下游分離純化過程帶來極大的壓力。而高效的細(xì)胞回收液澄清預(yù)處理將大大減輕后續(xù)抗體純化的壓力，對于縮短工藝流程、提高經(jīng)濟(jì)性具有決定性的作用。由此可見，評價細(xì)胞回收液澄清效果的主要標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴粏螁文苡行У厝コ溉閯游锛?xì)胞、細(xì)胞碎片，更重要是在保證最終抗體蛋白回收率的同時，盡可能多地去除宿主細(xì)胞蛋白(hostcellprotein,hcp)、宿主殘留dna、高分子量蛋白聚集體等污染物。

傳統(tǒng)單克隆抗體分離純化通常包括蛋白a親和層析純化、陰陽離子交換樹脂純化、疏水性作用樹脂純化等3-4步單元操作，工藝流程長、產(chǎn)品產(chǎn)率較低，導(dǎo)致單克隆抗體產(chǎn)品成本居高不下。因此如何縮短工藝流程、降低生產(chǎn)成本直接決定了在當(dāng)前上游產(chǎn)能大大提升狀況下，下游抗體分離純化的主要研究方向。離心和切向流過濾常被應(yīng)用于工業(yè)中去除細(xì)胞，最近幾年深層過濾的應(yīng)用也越來越廣泛。絮凝劑用來增強細(xì)胞、雜質(zhì)的去除和離心的效果也越來越受到廣泛的關(guān)注。沉淀法因具有操作簡單、省時省力、回收率高等特點在抗體分離純化中應(yīng)用廣泛。沉淀技術(shù)的原理是利用不同蛋白疏水性的差異，通過調(diào)節(jié)鹽濃度沉淀相應(yīng)的蛋白，達(dá)到分離純化的目的。辛酸是一種飽和脂肪酸，促進(jìn)酸性蛋白發(fā)生沉淀，等電點較高的單克隆抗體因具有足夠的電荷以中和辛酸的疏水作用，得以保留在上清液中，但是該方法會增加濁度和黏度，不利于分離上清液。所以本領(lǐng)域亟需一種更為簡單有效的沉淀法用于單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)液的澄清以增加后續(xù)分離純化的效率。因此，本發(fā)明的目的就是提供一種操作便捷、快速高效地基于脂肪酸沉淀的單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)液澄清的預(yù)處理方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種使細(xì)胞培養(yǎng)液澄清的預(yù)處理方法，以去除各種宿主細(xì)胞雜質(zhì)，所述方法包括以下步驟：

(1)在所述細(xì)胞培養(yǎng)回收液中添加9或10碳脂肪酸；

(2)調(diào)節(jié)并保持ph為5.0-5.5的反應(yīng)環(huán)境使脂肪酸與培養(yǎng)液反應(yīng)；反應(yīng)進(jìn)行20-40分鐘后加入精胺，所述精胺在酸性條件下呈現(xiàn)多陽離子多胺類特性，與dna結(jié)合以輔助并促進(jìn)抗體污染物的進(jìn)一步凝聚；

(3)降低反應(yīng)溫度至25℃以下并靜置，以使脂肪酸呈固態(tài)析出；

(4)去除步驟(3)析出的固態(tài)雜質(zhì)，收集上清液。

在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述脂肪酸為十碳脂肪酸，即癸酸。

在一個更為優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述培養(yǎng)液為cho細(xì)胞發(fā)酵獲得的培養(yǎng)液。

更為優(yōu)選地，在步驟(1)中，在細(xì)胞發(fā)酵結(jié)束前2-4小時至發(fā)酵結(jié)束后添加所述癸酸進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)液。

再為優(yōu)選地，步驟(1)中，所述癸酸的終濃度為0.2-1％。

尤為優(yōu)選地，步驟(1)中，所述癸酸的終濃度為0.4％。

在另一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述精胺的終濃度保持在0.1％。

在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述反應(yīng)的溫度為35-37℃。

在另一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述反應(yīng)的時間為2-4小時。

在另一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(3)中，所述靜置的時間為2-4小時。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1)操作簡單、耗時短、工作量小，可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2)操作溫度易控，符合常規(guī)工業(yè)生產(chǎn)設(shè)備要求。

3)應(yīng)用該方法純化的單克隆抗體的純度和收率高，hcp降低至低于500ppm，dna小于10ppb；igg1純度為95％以上，回收率高于90％。當(dāng)應(yīng)用賽多利斯雙級深層過濾時，利用癸酸沉淀后的細(xì)胞回收液濾過量是利用辛酸沉淀的兩倍以上。

附圖說明

圖1：利用癸酸沉淀分離純化單克隆抗體的流程圖一；

圖2：癸酸濃度與igg收率相關(guān)性曲線圖；

圖3：利用癸酸沉淀分離純化單克隆抗體的流程圖二

具體實施方式

參照以下實施例可以對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但以下實施例僅是例證，本發(fā)明并不局限于這些實施例。實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。無特殊說明，所有化學(xué)試劑均為商用常規(guī)分析純試劑。

癸酸，又名正癸酸、羊蠟酸(capricacid；decanoicacid；decatoicacid；decylicacid；decoicacid；nonane-d-carboxylicacid)，分子式：ch3(ch2)8co(oh)，分子量：172.27，cas號：334-48-5

其分子式如下式(i)所示：



癸酸主要用于制取癸酸酯類產(chǎn)品，其酯類用作香料、濕潤劑、增塑劑和食品添加劑等。

精胺，是含有兩個氨基和兩個亞氨基的多胺類物質(zhì)(中文別名：精堿精素；精胺；精素；n,n'-雙(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺；o,o-二甲基硫代磷酰胺；1,12-二氨基-4,9-二氮十二烷)，分子量：202.34，cas號：71-44-3。

其分子式如下式(ii)所示：



精胺可作為有機(jī)磷農(nóng)藥中間體。同時，精胺是典型的陰離子表面活性劑，具有良好的滲透、乳化、泡沫和去污能力，廣泛應(yīng)用于化工，農(nóng)藥、纖維、電渡、選礦等工業(yè)，尤其適用于化妝品、牙膏、香波等的制造。紡織工業(yè)中適用于洗滌羊毛和絲綢。

實施例1.單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)液的澄清(具體流程見圖1)

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：單克隆抗體igg1由cho表達(dá)產(chǎn)生，抗體在5l



b攪拌式玻璃生物反應(yīng)器中生產(chǎn)，采用分批補料的培養(yǎng)方式，利用1∶1的無蛋白培養(yǎng)基cdcho(lifetechnologies)和hyqpf(gehealthcare)。

(2)培養(yǎng)液預(yù)處理：將細(xì)胞培養(yǎng)液在室溫、4000×g條件下離心20min，之后經(jīng)由0.22μm濾膜(



rapid-flowfilters,thermoscientific)過濾，收集過濾液。

(3)沉淀污染物：在收集的過濾液中添加癸酸，使其終濃度為0.4％，通過添加1m醋酸或1mtris緩沖液將反應(yīng)ph調(diào)至5.0-5.5，在反應(yīng)進(jìn)行30分鐘后加入終濃度為0.1％的精胺。37℃混勻4h，攪拌速率控制在200-300rpm。之后將溫度降至25℃。

(4)分離污染物沉淀：4000g離心15min，收集上清液。

(5)檢測：通過generationiiichohcp試劑盒檢測，hcp降低至500ppm以下；由數(shù)字型pcr儀qx100tmdropletdigitaltmpcrsystem(bio-rad)測量dna小于10ppb；igg1純度為高于95％，回收率高于90％。

實施例2.不同癸酸濃度對宿主雜質(zhì)去除的影響

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：同實施例1。

(2)培養(yǎng)液預(yù)處理：同實施例1。

(3)沉淀污染物：在收集的過濾液中添加不同量的癸酸，使其終濃度分別為0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％，ph調(diào)至5.0-5.5，37℃混勻4h。將溫度降至25℃，靜置4h。

(4)分離污染物沉淀：同實施例1。

(5)檢測：同實施例1。結(jié)果顯示，綜合考慮抗體蛋白收率與宿主雜質(zhì)去除效率，0.4％的癸酸濃度為最優(yōu)(見圖2)。

實施例3.單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)液的澄清(具體流程見圖3)

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：同實施例1。

(2)添加癸酸：在發(fā)酵結(jié)束前4h添加癸酸，使其終濃度為0.4％。在反應(yīng)進(jìn)行30分鐘后加入0.1％精胺。

(3)降溫：發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐溫度降至25℃。

(4)分離沉淀和細(xì)胞：將發(fā)酵液進(jìn)行深層過濾去除細(xì)胞和污染物沉淀，收集過濾液。

(5)檢測：同實施例1。hcp降低至低于500ppm，dna小于10ppb；igg1純度為95％以上，回收率高于90％。

實施例4.辛酸和癸酸細(xì)胞培養(yǎng)液澄清對比

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：同實施例1。

(2)添加辛酸和癸酸：在發(fā)酵結(jié)束前4h添加癸酸，使其終濃度為0.4％。在反應(yīng)進(jìn)行30分鐘后加入0.1％精胺。

(3)降溫：發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐溫度降至25℃。

(4)分離沉淀和細(xì)胞：將發(fā)酵液進(jìn)行深層過濾去除細(xì)胞和污染物沉淀，收集過濾液。

(5)應(yīng)用賽多利斯雙級深層過濾，利用癸酸沉淀后的細(xì)胞回收液濾過量是利用辛酸沉淀的兩倍以上。

實施例5.應(yīng)用蛋白a親和層析分離癸酸澄清后細(xì)胞培養(yǎng)液

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：同實施例1。

(2)添加癸酸：在發(fā)酵結(jié)束前4h添加癸酸，使其終濃度為0.4％。在反應(yīng)進(jìn)行30分鐘后加入0.1％精胺。

(3)降溫：發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐溫度降至25℃。

(4)分離沉淀和細(xì)胞：將發(fā)酵液進(jìn)行深層過濾去除細(xì)胞和污染物沉淀，收集過濾液。

(5)經(jīng)過蛋白a分離純化單克隆抗體hcp降低至低于檢測線，dna小于1ppb；igg1純度為99％以上，回收率高于99％。而沒有經(jīng)過癸酸澄清的細(xì)胞回收液，hcp在500-1000ppm，dna小于1ppm；igg純度為95％，回收率為90-95％。

實施例6.應(yīng)用切向流過濾分離純化癸酸法澄清后的細(xì)胞培養(yǎng)液

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：同實施例1。

(2)添加癸酸：在發(fā)酵結(jié)束前4h添加癸酸，使其終濃度為0.4％。在反應(yīng)進(jìn)行30分鐘后加入0.1％精胺。

(3)降溫：發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐溫度降至25℃。

(4)分離沉淀和細(xì)胞：將發(fā)酵液進(jìn)行深層過濾去除細(xì)胞和污染物沉淀，收集過濾液。

(5)直接應(yīng)用切向流過濾濃縮進(jìn)行單克隆抗體的分離純化，hcp降低至低于100ppm，dna小于10ppb；igg1純度為95％以上，回收率高于95％。符合現(xiàn)有fda標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體蛋白產(chǎn)品。實現(xiàn)無色譜柱單克隆抗體分離純化。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)

本發(fā)明公開了一種基于9?10碳脂肪酸單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)液澄清的方法。所述方法是在發(fā)酵后期或發(fā)酵完成后在培養(yǎng)液中加入所述脂肪酸，溶液pH調(diào)至5.0?5.5，通過攪拌，在37℃呈液態(tài)的脂肪酸特異性吸附宿主蛋白、殘留DNA、抗體聚集體等污染物，反應(yīng)20?40分鐘后加入精胺，利用其在酸性條件下呈現(xiàn)多陽離子多胺類特性，與DNA結(jié)合以促進(jìn)污染物的進(jìn)一步凝聚；當(dāng)溫度降至25℃以下，所述脂肪酸呈固態(tài)析出，通過離心或過濾去除固態(tài)沉淀，即可達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)液澄清的預(yù)處理目的。本發(fā)明操作簡單、耗時短、溫度易控，極大減輕了后續(xù)蛋白純化的壓力，縮短了工藝流程，既可用于實驗室小體系制備，又可用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：宋海鵬

受保護(hù)的技術(shù)使用者：深圳市國創(chuàng)納米抗體技術(shù)有限公司

技術(shù)研發(fā)日：2017.05.01

技術(shù)公布日：2017.07.11 專利名稱：一種浮選菱鎂礦礦石的藥劑制度的制作方法

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明是利用浮選工藝方法提純菱鎂礦礦石的一種藥劑制度。

目前為得到質(zhì)量較高的菱鎂礦精礦，包括高純的菱鎂礦精礦，常采用浮選法脫除菱鎂礦礦石中伴生的含鈣、硅和鐵的有害雜質(zhì)礦物，如白云石、方解石、各種硅酸鹽和石英。通常采用的浮選工藝是首先以脂肪胺或芳香胺化合物作為撲收劑，用反浮選法除去菱鎂礦礦石中伴生的石英和部分硅酸鹽礦物，然后再以脂肪酸類化合物作為撲收劑，配合使用各種抑制劑用正浮選法除去白云石、方解石和部分硅酸鹽礦物。當(dāng)以上述胺類化合物作為撲收劑，利用反浮選法提純菱鎂礦礦石時，胺類撲收劑對菱鎂礦和白云石、方解石及部分硅酸鹽的作用均較弱，有用礦物菱鎂礦和有害雜質(zhì)礦物的可浮性之間的差異小，因而不能有效的脫除菱鎂礦礦石中的雜質(zhì)礦物，還往往提高了菱鎂礦和粗精礦中的鈣含量，並且對一些硅酸鹽的撲收作用也不太好。另外使用上述工藝及藥劑制度時，工藝較復(fù)雜;藥劑種類較多。正浮選時需將礦漿加溫，為生產(chǎn)操作和管理帶來不便，由于工藝和藥劑制度較復(fù)雜，為菱鎂礦浮選廠的回水綜合利用帶來困難。

為解決上述問題本發(fā)明提出了一種加調(diào)整劑的藥劑制度。在反浮選過程中加入適量的無機(jī)磷酸鹽(包括各種正磷酸鹽、偏磷酸鹽、聚磷酸鹽和焦磷酸鹽)，提高了胺類化合物對白云石、方解石和硅酸鹽類礦物的撲收能力，而菱鎂礦的可浮性同未加無機(jī)磷酸鹽時的可浮性基本相同。從而增強了反浮選過程脫去含鈣、硅和鐵的有害雜質(zhì)礦物的作用。本發(fā)明的藥劑制度只需反浮選工藝即可達(dá)到目前通常采用的反浮選-正浮選聯(lián)合工藝才能達(dá)到的選別技術(shù)指標(biāo)(精礦品位和有用礦物回收率)。

本發(fā)明的具體內(nèi)容敘述如下在使用脂肪胺和芳香胺化合物作為撲收劑，利用反浮選工藝方法除去菱鎂礦礦石中的雜質(zhì)時，加入適量的無機(jī)磷酸鹽(包括正磷酸鹽、偏磷酸鹽、聚磷酸鹽和焦磷酸鹽)作為調(diào)整劑。為獲得最佳的選別技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，使用本發(fā)明的藥劑制度時需根據(jù)待選別的菱鎂礦礦石性質(zhì)來確定使用的各種藥劑的合適用量和最佳PH值范圍，處理菱鎂礦原礦時，撲收劑胺類化合物的用量通常為50g/T～300g/T，無機(jī)磷酸鹽的用量通常為50g/T～500g/T，介質(zhì)PH值范圍可在3～10之間。無機(jī)磷酸鹽可加入到調(diào)漿槽里，也可加在磨機(jī)或浮選機(jī)中，通過加入調(diào)整劑增強了胺類撲收劑對白云石、方解石和一些硅酸鹽雜質(zhì)礦物的撲收作用;改善了分選效果;提高了利用浮選法提純菱鎂礦礦石的技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。

采用本發(fā)明藥劑制度的工藝同傳統(tǒng)的菱鎂礦浮選工藝相比較，具有以下優(yōu)越性1.可減少60%的浮選機(jī)，降低了菱鎂礦浮選廠的基建投資。

2.可減少浮選藥劑的數(shù)量和種類，降低能耗和減少現(xiàn)場管理人員，可使生產(chǎn)每噸菱鎂礦精礦的成本降低50%～60%。

3.可增加反浮選泡沫產(chǎn)品的流動性，使其便于處理和輸送。

4.工藝簡化后可提高選礦廠回水綜合利用水平。

下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體說明用本發(fā)明藥劑制度，采用反浮選小型試驗工藝對一級菱鎂礦粉礦進(jìn)行選別試驗。具體實驗條件是經(jīng)鹽酸中和后的十二胺用量150g/T，六聚偏磷酸鈉用量200g/T(或磷酸二氫鈉250g/T，或焦磷酸鈉250g/T)。用工業(yè)鹽酸調(diào)整介質(zhì)PH值到4～6。加藥順序如下鹽酸，無機(jī)磷酸鹽，十二胺。首先選別4.0分鐘，得到產(chǎn)率為25%～28%的最終尾礦，然后再浮選3.5分鐘即可得到產(chǎn)率為40%～45%的最終精礦和產(chǎn)率為27%～35%的中礦，原礦和各種產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)見下表種類產(chǎn)率燒堿 Sio2Al2O3Fe2O3CaO MgO MgO%(鎂砂中)精石46.2151.550.040.010.310.5147.5398.20中礦25.9151.400.150.060.400.6047.3097.50尾礦27.8849.712.160.790.801.0045.2790.50原礦10050.000.660.230.470.6746.8495.8權(quán)利要求

1.一種利用浮選工藝方法提純菱鎂礦礦石的藥劑制度，本發(fā)明的特征是當(dāng)用胺類化合物作為撲收劑時，加入無機(jī)磷酸鹽作為調(diào)整劑，在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)PH值范圍內(nèi)，用反浮選工藝提純菱鎂礦礦石。

2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的無機(jī)磷酸鹽包括各種正磷酸鹽、偏磷酸鹽、聚磷酸鹽和焦磷酸鹽。

3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的適當(dāng)介質(zhì)PH值范圍根據(jù)待選的菱鎂礦礦石性質(zhì)而定，介質(zhì)PH值可在3～10范圍內(nèi)變化。

全文摘要

本發(fā)明是利用浮選工藝方法提純菱鎂礦礦石的一種藥劑制度。其特點是使用胺類撲收劑通過反浮選工藝脫除菱鎂礦雜質(zhì)時，加入適量的無機(jī)磷酸鹽，改善分選效果。這樣對菱鎂礦礦石只進(jìn)行一次反浮選處理即可達(dá)到目前用反浮選—正浮選聯(lián)合工藝處理方可達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)。簡化了目前菱鎂礦礦石浮選工藝流程。減少了浮選藥劑的種類、數(shù)量、設(shè)備投資和管理費用。使生產(chǎn)成本降低50％～60％。有利于反浮選泡沫產(chǎn)品的輸送和提高菱鎂礦浮選廠的回水利用率。

文檔編號B03D1/00GK1037098SQ89104249

公開日1989年11月15日 申請日期1989年6月24日 優(yōu)先權(quán)日1989年6月24日

發(fā)明者李曉安, 董淑緩, 王義強 申請人:鞍山鋼鐵學(xué)院