權(quán)利要求

1.一株彎曲假單胞菌，其分類命名為彎曲假單胞菌（ Pseudomonas geniculata），菌株名為PH-2，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2021年12月6日，保藏編號(hào)為CGMCC No.24039。2.微生物菌劑，其特征在于，由權(quán)利要求1所述彎曲假單胞菌制得。 3.權(quán)利要求2所述微生物菌劑的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求1所述彎曲假單胞菌的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即得所述微生物菌劑。 4.根據(jù)權(quán)利要求3所述微生物菌劑的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為甲基異丁酮2g/L，葡萄糖8g/L，(NH 4) 2SO 4 1g/L，K 2HPO 4 2g/L，MgSO 4 0.5g/L，NaCl 1g/L%，CaCO 3 0.5g/L，酵母膏2g/L，pH值為7.2~7.5。 5.根據(jù)權(quán)利要求3所述微生物菌劑的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵的過(guò)程中，空氣的通氣量與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1：0.6~1.2，攪拌速度為180~240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30~35℃。 6.權(quán)利要求1所述彎曲假單胞菌，或權(quán)利要求2所述微生物菌劑，或權(quán)利要求3~5中任意一項(xiàng)所述微生物菌劑的制備方法制備得到的微生物菌劑在降解甲基異丁酮中的應(yīng)用。 7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為在處理含甲基異丁酮的化工廢水中的應(yīng)用。 8.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述降解的溫度為10~30℃。 9.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，待降解物中，氯化鈉的濃度為0.1~10.5g/L。 10.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述降解的時(shí)間為4~72h。

說(shuō)明書

一株化工溶劑降解菌彎曲假單胞菌PH-2及其在化工廢水處理中的應(yīng)用

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于化工廢水生物處理領(lǐng)域，具體涉及一株化工溶劑降解菌彎曲假單胞菌PH-2及其在化工廢水處理中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來(lái)，隨著化工行業(yè)的不斷發(fā)展，化工生產(chǎn)中所產(chǎn)生的廢水量大幅增加，化工廢水對(duì)于環(huán)境的污染不斷加劇?；どa(chǎn)過(guò)程中排放的廢水具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、難以降解、有毒等特點(diǎn)，為此其處理過(guò)程非常復(fù)雜，處理投入的資本也很高。由于在化工生產(chǎn)過(guò)程中，經(jīng)常涉及調(diào)酸、調(diào)堿或酸堿中和等操作，所以化工生產(chǎn)廢水往往存在高鹽的特點(diǎn)，有些廢水中的氯化鈉含量會(huì)高達(dá)10%-20%，對(duì)生化處理過(guò)程造成嚴(yán)重抑制。

生化處理技術(shù)作為治理水環(huán)境污染公認(rèn)的最經(jīng)濟(jì)、最有效的方法，其最核心的技術(shù)在于高效的微生物菌劑。目前常規(guī)的微生物菌劑的獲得方式有通過(guò)所需要種類微生物的定向純化培養(yǎng)或者富集篩選培養(yǎng)以及從活性污泥法中定向培養(yǎng)獲得。針對(duì)污廢水中特定污染物降解的純化培養(yǎng)的微生物，雖然培養(yǎng)純度、濃度較高，培養(yǎng)速度較快，但是投放至被處理污廢水中，但實(shí)際廢水（尤其是化工廢水）中的高鹽、高毒等環(huán)境會(huì)對(duì)這類菌株有一定程度毒害作用，從而使得該純化菌種很難適應(yīng)，甚至死亡。同時(shí)，受季節(jié)和地域影響，很多污水處理裝置在運(yùn)行過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)溫度較低（甚至低于15℃），雖然可以通過(guò)保溫加溫等處理提高運(yùn)行溫度，但往往還是會(huì)對(duì)一些特定馴化的菌株有明顯的抑制作用。

甲基異丁酮（MIBK）是一種性能優(yōu)良的中沸點(diǎn)溶劑和化工中間體，廣泛用于化工合成過(guò)程，水中溶解度約17000mg/L，應(yīng)用過(guò)程中難以回收，基本隨廢水排放。由于其性質(zhì)穩(wěn)定，一般生化處理難以降解。隨著環(huán)保形勢(shì)的嚴(yán)峻化，全國(guó)范圍化工園區(qū)都在整治提標(biāo)，COD等污染指標(biāo)的排放濃度也將會(huì)逐漸降低，以提高排放標(biāo)準(zhǔn)。目前關(guān)于MIBK的降解菌株還鮮有報(bào)道，因此本發(fā)明以MIBK為目標(biāo)污染物，在高鹽和低溫環(huán)境進(jìn)行菌株馴化，獲得一株耐低溫高鹽的MIBK高效菌株，并應(yīng)用于化工廢水處理中，為MIBK高效降解微生物的應(yīng)用提供理論和技術(shù)支持，為MIBK環(huán)境污染的生物修復(fù)提供一種新的微生物資源。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株彎曲假單胞菌。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種微生物菌劑。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述微生物菌劑的制備方法。

本發(fā)明進(jìn)一步要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述彎曲假單胞菌以及上述微生物菌劑的應(yīng)用。

為了解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一株彎曲假單胞菌，其分類命名為彎曲假單胞菌（ Pseudomonas geniculata），菌株名為PH-2，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2021年12月6日，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)，保藏編號(hào)為CGMCC No.24039。

為了解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種微生物菌劑，其由上述彎曲假單胞菌制得。

為了解決上述第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了上述微生物菌劑的制備方法，即將上述彎曲假單胞菌的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即得所述微生物菌劑。

其中，所述種子液的制備方法包括：斜面種－搖瓶種－種子罐，具體為將上述彎曲假單胞菌接種于添加甲基異丁酮的LB培養(yǎng)基（NaCl 10.00g/L，蛋白胨10.00g/L，酵母粉5.00g/L，甲基異丁酮2g/L，pH7.0）中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；所得菌種按10%的接種量接種入種子罐（所述種子罐的培養(yǎng)基與上述發(fā)酵培養(yǎng)基相同），培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（相應(yīng)的培養(yǎng)參數(shù)與上述發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的參數(shù)相同），即種子液。

其中，所述培養(yǎng)基的組成為甲基異丁酮2g/L，葡萄糖8g/L，(NH 4) 2SO 4 1g/L，K 2HPO 42g/L，MgSO 4 0.5g/L，NaCl 1g/L，CaCO 3 0.5g/L，酵母膏2g/L，pH值為7.2~7.5。

其中，所述發(fā)酵過(guò)程中，空氣的通氣量與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1：0.6~1.2，攪拌速度為180~240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30~35℃。

其中，所述菌劑可以是發(fā)酵完成后的發(fā)酵液；所述微生物菌劑為直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。

為了解決上述第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了上述彎曲假單胞菌，或上述微生物菌劑，或上述方法制備得到的微生物菌劑在降解甲基異丁酮中的應(yīng)用。

其中，所述應(yīng)用為在處理含甲基異丁酮的化工廢水中的應(yīng)用。

其中，所述降解的溫度為5~35℃，優(yōu)選為10~25℃。

其中，待降解物中，氯化鈉的濃度為0.1~10.5g/L，優(yōu)選為0.5~10g/L。

其中，所述降解的時(shí)間為4~72h。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)：

本發(fā)明所述的彎曲假單胞菌PH-2可以應(yīng)用于高鹽化工廢水中且耐受低溫條件。所制備的菌劑具有生產(chǎn)使用成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合在全國(guó)的化工廢水處理中降解甲基異丁酮（MIBK）。本發(fā)明是利用微生物的方法降解有機(jī)污染物，化工園區(qū)廢水處理提標(biāo)具有重要意義。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做更進(jìn)一步的具體說(shuō)明，本發(fā)明的上述和/或其他方面的優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更加清楚。

圖1為本發(fā)明所述的彎曲假單胞菌PH-2在LB固體培養(yǎng)基的菌落形態(tài)。

圖2為本發(fā)明所述的彎曲假單胞菌PH-2對(duì)鹽度的耐受性。

圖3為溫度對(duì)本發(fā)明所述的彎曲假單胞菌PH-2降解效果的影響。

圖4為彎曲假單胞菌PH-2在化工廢水處理中的應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

下述實(shí)施例中所述接種量均為按照相應(yīng)體積比進(jìn)行接種。

實(shí)施例1：彎曲假單胞菌PH-2的分離篩選

取從江蘇的某農(nóng)藥企業(yè)（該企業(yè)部分產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中利用MIBK作為原料溶劑）生產(chǎn)車間的廢水處理池中得到的活性污泥3.0ml加入100ml甲基異丁酮濃度為200mg/L的含有甲基異丁酮的無(wú)機(jī)鹽配培養(yǎng)基中，其配方為：NaCl 5.0g，(NH 4) 2SO 4 1.0g，K 2HPO 4.7H 2O1.96g，KH 2PO 4 0.5g，MgSO 4.7H 2O 0.2g，去離子水補(bǔ)足至1000 mL，pH 7.0~7.2，在121℃下滅菌20 min，10℃條件下振蕩培養(yǎng)，每隔10天按3%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次。

取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml無(wú)菌水中，配成10 -1的富集液，再吸取1.0ml配好的10 -1的富集液加入9.0ml無(wú)菌水中，充分混勻配成10 -2的富集液，以此類推，對(duì)富集液進(jìn)行梯度稀釋。吸取各梯度的稀釋液0.1ml涂布于含MIBK的濃度200mg/L無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基（配方如上），30℃培養(yǎng)10天。10天后從以上的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，于3.0ml的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，LB液體培養(yǎng)基配方為：甲基異丁酮2g/L，NaCl10.00g/L，蛋白胨10.00g/L，酵母粉5.00g/L，pH7.0；于8000r/min的條件下離心2min，倒去上清液，加入3.0ml的無(wú)菌水搖勻，仍于8000r/min的條件下離心2min，按此方法用無(wú)菌水洗兩遍后，加入3.0ml無(wú)菌水重懸該菌。吸取1.0ml該菌液加入100ml甲基異丁酮濃度為200mg/L的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中(配方為：每升含200mg甲基異丁酮，1.50g K 2HPO 4、0.50g KH 2PO 4、0.20g MgSO 4.7H 2O、1.00g NaCl、1.00g (NH 4) 2SO 4，20.00g 瓊脂， pH 7.0)，于160r/min，30℃條件下振蕩培養(yǎng)96h后，用氣相色譜測(cè)其降解效果。將降解效率較高的一株菌株保存即彎曲假單胞菌PH-2（保藏號(hào)為CGMCC No.24039），其在LB固體培養(yǎng)基的菌落形態(tài)如圖1所示，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2：本發(fā)明所述的彎曲假單胞菌PH-2對(duì)鹽度的耐受性

分別配置含有不同NaCl濃度的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（配方為：每升含200mg甲基異丁酮，1.50g K 2HPO 4、0.50g KH 2PO 4、0.20g MgSO 4.7H 2O、1.00g NaCl、1.00g (NH 4) 2SO 4，20.00g瓊脂，pH 7.0），121℃滅菌20min冷卻后，按照1%的比例加入實(shí)施例1中彎曲假單胞菌PH-2的菌液（即3.0ml無(wú)菌水重懸該菌），于160r/min，30℃培養(yǎng)96h，分別檢測(cè)無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中MIBK的濃度以及LB液體培養(yǎng)基中菌液濃度。結(jié)果如圖2所示，在0.5~10g/L氯化鈉的濃度下，彎曲假單胞菌PH-2均能有效降解MIBK。

實(shí)施例3：溫度對(duì)本發(fā)明所述的彎曲假單胞菌PH-2降解效果的影響

配置甲基異丁酮濃度為200mg/L的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中(配方為：每升含200mg甲基異丁酮，1.50g K 2HPO 4、0.50g KH 2PO 4、0.20g MgSO 4.7H 2O、1.00g NaCl、1.00g (NH 4) 2SO 4，20.00g 瓊脂，pH 7.0)，121℃滅菌20min冷卻后，按照1%的比例加入實(shí)施例1中彎曲假單胞菌PH-2的菌液（即3.0ml無(wú)菌水重懸該菌），設(shè)置轉(zhuǎn)速160r/min，分別至于10℃、15℃、20℃、25℃和30℃條件下振蕩培養(yǎng)96h后，用氣相色譜測(cè)其降解效果。結(jié)果如圖3所示，在10~30℃下，彎曲假單胞菌PH-2均能有效降解MIBK。

實(shí)施例4：本發(fā)明所述的彎曲假單胞菌PH-2對(duì)化工廢水中MIBK的處理效果

將本發(fā)明所述的彎曲假單胞菌PH-2菌液（即3.0ml無(wú)菌水重懸該菌）按照0.5%的接種量接種于江蘇某農(nóng)藥企業(yè)生產(chǎn)廢水中（經(jīng)測(cè)定，該廢水中甲基異丁酮濃度為252mg/L，氯化鈉濃度7528mg/L），該企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中利用甲基異丁酮作為原料溶劑，使用后不回收。將接種后的廢水分別至于10℃和25℃條件下，測(cè)定廢水中甲基異丁酮濃度。結(jié)果如圖4所示，在一定時(shí)間后彎曲假單胞菌PH-2在10℃和25℃均能有效降解MIBK。

實(shí)施例5：PH-2菌劑的制備：

1）將彎曲假單胞菌PH-2菌液接種于添加甲基異丁酮的LB培養(yǎng)基（NaCl 10.00g/L，蛋白胨10.00g/L，酵母粉5.00g/L，甲基異丁酮2g/L）中，30℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；

2）將步驟1）培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入種子罐（甲基異丁酮2g/L，葡萄糖8g/L，(NH 4) 2SO 4 1g/L，K 2HPO 4 2g/L，MgSO 4 0.5g/L，NaCl 1g/L%，CaCO 3 0.5g/L，酵母膏2g/L，pH值為7.2~7.5），培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即種子液；

3）將步驟2）所述種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同，無(wú)菌空氣的通氣量為1：0.8，攪拌速度為240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30℃，步驟2）和步驟3）的整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為60小時(shí)，發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液即為菌劑；所述菌劑直接分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。

綜上，本發(fā)明分離到一株可以在低溫高鹽條件下降解甲基異丁酮的高效菌株P(guān)H-2，該菌株在氯化鈉含量10g/L以及最低10℃條件下96h內(nèi)降解200mg/L甲基異丁酮，降解率達(dá)到80%以上，以解決高鹽化工廢水中低溫條件下甲基異丁酮的處理問(wèn)題。

本發(fā)明提供了一株化工溶劑降解菌彎曲假單胞菌PH-2及其在化工廢水處理中的應(yīng)用的思路及方法，具體實(shí)現(xiàn)該技術(shù)方案的方法和途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。本實(shí)施例中未明確的各組成部分均可用現(xiàn)有技術(shù)加以實(shí)現(xiàn)。

序列表

<110> 江蘇樸厚環(huán)境工程有限公司

<120> 一株化工溶劑降解菌彎曲假單胞菌PH-2及其在化工廢水處理中的應(yīng)用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1445

<212> DNA

<213> 彎曲假單胞菌(Pseudomonas geniculata)

<400> 1

gcggggcggt agctacacat gcagtcgaac ggcagcacag gagagcttgc tcctctgggt 60

ggcgagtggc ggacgggtga ggaatacatc ggaatctact ctgtcgtggg ggataacgta 120

gggaaactta cgctaatacc gcatacgacc tacgggtgaa agcaggggat cttcggacct 180

tgcgcgattg aatgagccga tgtcggatta gctagttggc ggggtaaagg cccaccaagg 240

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tggatactgg gcgactagag tgtggtagag ggtagcggaa ttcctggtgt agcagtgaaa 660

tgcgtagaga tcaggaggaa catccatggc gaaggcagct acctggacca acactgacac 720

tgaggcacga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa 780

cgatgcgaac tggatgttgg gtgcaatttg gcacgcagta tcgaagctaa cgcgttaagt 840

tcgccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900

caagcggtgg agtatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tggccttgac 960

atgtcgagaa ctttccagag atggatcggt gccttcggga actcgaacac aggtgctgca 1020

tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080

tgtccttagt tgccagcacg taatggtggg aactctaagg agaccgccgg tgacaaaccg 1140

gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggccagggct acacacgtac 1200

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cggtg 1445

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