本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種胰島素及其類似物O?糖基化位點(diǎn)的鑒定方法。首先對(duì)胰島素及其類似物進(jìn)行彈性蛋白酶酶切，通過(guò)LC?MS分析肽圖譜，初步確定相應(yīng)的糖基化肽段；然后對(duì)糖基化關(guān)鍵肽段進(jìn)行Q?TOF?MS/MS分析，通過(guò)優(yōu)化關(guān)鍵肽段的CID質(zhì)譜碎裂能量，得到關(guān)鍵的帶糖的碎片離子，從而更準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便的分析O糖基化位點(diǎn)。本發(fā)明在常規(guī)CID碎裂技術(shù)下即可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜肽段的糖基化位點(diǎn)分析和確認(rèn)，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，實(shí)用性強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)，適用于所有帶有CID碎裂技術(shù)的質(zhì)譜儀，為糖基化類的翻譯后修飾分析以及在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用提供了一種新的思路。