本發(fā)明公開了一種氨基糖苷類雙功能修飾酶AAC(6′)?APH(2″)抑制劑的篩選方法，包括如下步驟：采用化學(xué)法進行aac(6′)?aph(2″)的基因合成，表達并純化氨基糖苷類雙功能修飾酶AAC(6′)?APH(2″)；建立氨基糖苷類雙功能修飾酶AAC(6′)?APH(2″)的體外反應(yīng)體系，將待篩選物質(zhì)與氨基糖苷類抗生素和輔酶因子進行混合，加入氨基糖苷類雙功能修飾酶AAC(6′)?APH(2″)使之反應(yīng)，同時設(shè)立空白對照組，用水代替待篩選物質(zhì)；采用內(nèi)標(biāo)法對反應(yīng)產(chǎn)物進行高效液相分離和質(zhì)譜定量檢測；計算抑制率，篩選出對氨基糖苷類雙功能修飾酶AAC(6′)?APH(2″)具有抑制作用的活性物質(zhì)。本發(fā)明公開的方法操作簡單、靈敏度高、可重復(fù)性強，假陽性概率低。樣品前處理簡單，檢測結(jié)果直觀，大大提高了篩選AAC(6′)?APH(2″)抑制劑的速度和成功率，可以對大批量樣品庫進行篩選，更具實用性。