本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于LC?MS/MS法檢測(cè)25?羥基膽固醇的方法、試劑盒及其應(yīng)用，該方法包括：對(duì)待測(cè)生物樣本進(jìn)行預(yù)處理；對(duì)經(jīng)過(guò)預(yù)處理的待測(cè)生物樣本進(jìn)行LC?MS/MS檢測(cè)，得到所述待測(cè)生物樣本的圖譜，利用同位素內(nèi)標(biāo)法，以25?羥基膽固醇?d6為內(nèi)標(biāo)物，采用25?羥基膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，計(jì)算所述待測(cè)生物樣本中的25?羥基膽固醇的濃度；液相色譜條件包括：采用梯度洗脫，色譜柱為長(zhǎng)度不大于50mm的EC?C18色譜柱，流動(dòng)相A為含甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含甲酸的乙腈。本發(fā)明提供的方法靈敏度高、分析時(shí)間短。