本發(fā)明提供了一種表面功能化納米纖維細菌檢測膜及其制備方法和應用，屬于生物化學技術(shù)領(lǐng)域。該表面功能化納米纖維細菌檢測膜為表面接枝有顯色底物的功能化納米纖維細菌檢測膜，首先制備一種聚乙烯醇?乙烯共聚物納米纖維膜，對其進行表面功能化處理，然后在其表面接枝能夠與細菌中的特異性酶發(fā)生酶促反應的顯色底物，得到表面功能化納米纖維細菌檢測膜。將本發(fā)明制備的細菌檢測膜浸泡在細菌懸浮液中，顯色底物在細菌中的特異性酶的作用下發(fā)生酶促反應，解離出顯色物質(zhì)，通過測試細菌檢測膜表面或溶液的熒光強度或吸光度或者顏色深度變化，實現(xiàn)對細菌濃度的可視化、快速、可靠和特異性的靈敏檢測。