本發(fā)明公開了一種核酸羥甲基化修飾的檢測方法及其應(yīng)用，所述方法包括以下步驟：將核酸樣品分為兩份，分別為第一樣品和第二樣品；所述第一樣品依次經(jīng)過氧化反應(yīng)、亞硫酸鹽處理和PCR擴(kuò)增，得到氧化硫化擴(kuò)增物；所述第二樣品依次經(jīng)過亞硫酸鹽處理和PCR擴(kuò)增，得到硫化擴(kuò)增物；將所述氧化硫化擴(kuò)增物與所述硫化擴(kuò)增物雜交產(chǎn)生錯(cuò)配，形成雜交結(jié)構(gòu)；酶切割所述雜交結(jié)構(gòu)，得到目標(biāo)樣品；采用生化傳感器對所述目標(biāo)樣品進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明利用錯(cuò)配切割酶識別由于氧化反應(yīng)在羥甲基胞嘧啶位點(diǎn)產(chǎn)生的錯(cuò)配，借助電化學(xué)平臺產(chǎn)生差別信號，能夠檢測基因中任意位點(diǎn)的羥甲基胞嘧啶變化情況，從而可以成為細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生及藥物療效等評估的關(guān)鍵技術(shù)和手段。