用種植體替代缺失牙已經(jīng)成為一種常規(guī)的治療選擇，其適應(yīng)癥不斷擴(kuò)大 純鈦(Ti)和鈦合金是應(yīng)用最為廣泛的種植體材料 單顆牙或前牙的缺失，往往使牙間隙和牙根間隙不足或頜骨改建后其寬度很窄[1] 對此除了進(jìn)行常規(guī)的附加骨增量[2]，還可選用窄直徑種植體 但是，與常規(guī)直徑的種植體相比，相同強(qiáng)度水平的窄直徑種植體的承載能力會下降，應(yīng)力水平的提高使疲勞折裂的風(fēng)險大大增加[3] 因此，不推薦用窄直徑種植體修復(fù)單獨(dú)的尖牙、前磨牙和磨牙 為了提高種植體的機(jī)械強(qiáng)度，新近發(fā)展出的高強(qiáng)度鈦鋯(Ti-Zr)合金的窄直徑種植體已經(jīng)臨床應(yīng)用 例如，Straumann公司推出的Roxolid鈦鋯合金種植體，其機(jī)械性能較高，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其耐蝕性能、骨親和力和生物相容性等都不低于純鈦[3-5]，其硬度、彈性模量，拉伸和抗曲強(qiáng)度甚至優(yōu)于純鈦[6]

一些病例表明，種植體失敗最常見的原因是其周圍黏膜炎和種植體周圍炎[7] 這些炎癥，與種植體表面生成的細(xì)菌生物膜使種植體感染相關(guān) 鈦合金是生物惰性材料，沒有抗菌性能，因此賦予其抗菌性能對于開發(fā)窄直徑種植體意義重大 目前許多研究都集中在減少鈦種植體表面上的細(xì)菌粘附，包括表面處理[8]、光化學(xué)反應(yīng) [9]、銀合金化[10]以及銅合金化[11~13] 與添加銀相比，添加銅的抗菌效果更好[14] 銀只有在較高的溫度下才具有較強(qiáng)的抗菌性能[15]，而銅在模擬體內(nèi)環(huán)境的體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌性能[16]

銅(Cu)元素是人體中必須的微量元素，參與細(xì)胞代謝、分化和催化等生理功能[17] 銅也是生物體內(nèi)多種蛋白和酶的合成組分，在維持人體新陳代謝方面有重要的作用 同時，銅的加入還能提高金屬材料的耐蝕性能[18] 本文在目前臨床使用的Ti-Zr合金中添加3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Cu，研究Ti-Zr-Cu合金的抗菌性能和生物相容性

1 實(shí)驗(yàn)方法1.1 樣品的制備

實(shí)驗(yàn)用材料為Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金，其化學(xué)成分列于表1 將實(shí)驗(yàn)材料(包括空白)切割成直徑為10 mm、厚度為2 mm的圓片，依次用150#、400#、800#、1200#碳化硅砂紙打磨 實(shí)驗(yàn)前，將空白樣品(blank)、Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金樣品依次用去離子水、75%無水乙醇和100%無水乙醇超聲充分清洗，并進(jìn)行高溫高壓滅菌

Table 1

表1

表1Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金的化學(xué)成分

Table 1Compositions of Ti-Zr alloy and Ti-Zr-Cu alloy (%, mass fraction)

Alloy	Ti	Zr	Cu	Fe	C	O	N	H
Ti-Zr	Bal.	15.20	0.01	0.04	0.05	0.07	0.004	0.002
Ti-Zr-Cu	Bal.	14.50	3.00	0.04	0.04	0.08	0.007	0.002

1.2 抗菌性能的表征

采用平板共培養(yǎng)計數(shù)法，使用感染性細(xì)菌菌株——革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)和革蘭氏陰性大腸桿菌(ATCC 8739)評價實(shí)驗(yàn)材料的抗菌性能

用蒸餾水配置LB培養(yǎng)基(牛肉膏5 g/L，氯化鈉5 g/L，蛋白胨10 g/L)和瓊脂培養(yǎng)皿(牛肉膏5 g/L，氯化鈉5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂23 g/L)，調(diào)整其pH值為7.2~7.4，并進(jìn)行高溫高壓處理 先將兩種細(xì)菌菌株的冷凍粉溶解在LB培養(yǎng)基中，在溫度為37℃的搖床中培養(yǎng)24 h得到細(xì)菌懸液 將細(xì)菌懸浮液涂布在營養(yǎng)瓊脂平皿上，置于溫度為37℃、濕度高于90%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 然后用PBS將細(xì)菌菌落配制成濃度為108 cfu/mL的細(xì)菌懸液，分別調(diào)整大腸桿菌(OD0.150±0.02)和金黃色葡萄球菌(OD0.325±0.02)的光密度，將其濃度稀釋為105 cfu/mL

將50 μL稀釋后的菌液分別滴加在空白、Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金樣品的表面，使菌液均勻鋪開完全覆蓋樣品的表面 每組設(shè)置4個平行樣品，將其放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 到達(dá)時間后, 將樣品連同其上的菌液一同移至離心管中，加入3 mL的無菌PBS溶液，渦旋震蕩1 min得到洗脫液 取100 μL洗脫液均勻涂布在瓊脂培養(yǎng)基的平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出平板拍照 計數(shù)每個樣品平板上的菌落數(shù)，并計算每組樣品表面上的平均菌落數(shù) 實(shí)驗(yàn)材料的殺菌率為

R(%)=(N-N1)/N×100%

(1)

式中N為對照樣品表面上的菌落數(shù)；N1為實(shí)驗(yàn)樣品表面上的菌落數(shù) 如果R≥90%，則表明實(shí)驗(yàn)樣品具有強(qiáng)烈的殺菌性能

1.3 生物相容性的表征1.3.1 CCK8細(xì)胞增殖

使用空白、Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金樣品表征細(xì)胞增殖，每種材料設(shè)置四組平行樣品 將小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞 MC3T3-E1配制成濃度為2×104個/mL的細(xì)胞懸液 將空白樣、Ti-Zr-Cu合金和Ti-Zr合金各四組平行樣品置于48孔板中 用PBS充分清洗樣品棄凈后，將500 μL/孔細(xì)胞懸液均勻滴加在其表面 在37℃、5% CO2條件下，在恒溫培養(yǎng)箱(Thermo 公司)中分別培養(yǎng)1 d、4 d和7 d 到達(dá)時間點(diǎn)后棄凈培養(yǎng)基并用PBS充分沖洗樣品表面 在每孔滴加含10%CCK-8的無血清αMEM培養(yǎng)基300 μL，再將其在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，然后每孔取100 μL溶液用酶標(biāo)儀(Infinite M200型)，測定其在450 nm波長處的光密度(OD)

細(xì)胞的相對增殖率(Relative growth rate，RGR)為

RGR(%)=ODTi-Zr-Cu/ODTi-Zr×100%

(2)

式中OD為450 nm處的光密度 根據(jù)細(xì)胞相對增殖率并依據(jù)細(xì)胞毒性的分級標(biāo)準(zhǔn)(表2[19])，評價細(xì)胞毒性等級

Table 2

表2

表2細(xì)胞毒性的分級標(biāo)準(zhǔn)和評定結(jié)果

Table 2Grade standard and evaluation result of cytoxicity

Level	RGR/%	Evaluation results
0	≥100	Qualified
1	75~99	Qualified
2	50~74	Overview
3	25~49	Failed
4	0~24	Failed

1.3.2 鬼筆環(huán)肽細(xì)胞骨架染色

在相同條件下將細(xì)胞接種在Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金樣品表面，然后放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 到達(dá)時間點(diǎn)后棄培養(yǎng)基，將樣品取出并移入新的24孔板中，用PBS充分清洗后使用4%多聚甲醛固定10 min 再用PBS清洗并用0.2%TritonX-100 透膜處理 6 min，然后加入羅丹明-鬼筆環(huán)肽避光染色40 min 到時間點(diǎn)后用PBS再次充分清洗，隨后在避光條件下用DAPI染色5 min 用PBS清洗后，將已固定好細(xì)胞的樣品置于載玻片上，在Olympus熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核及細(xì)胞骨架形貌并拍照

1.3.3 細(xì)胞凋亡的檢測

使用流式細(xì)胞儀采用FITC/PI雙染法測定細(xì)胞凋亡 按照1×104個/cm2的密度將細(xì)胞接種在空白、Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金樣品表面，然后放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 到達(dá)時間點(diǎn)后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞 用冷PBS緩沖溶液輕吹重懸細(xì)胞后，在低于4℃以1000 r/min的轉(zhuǎn)速離心分離5 min后棄液，重復(fù)兩次后在每管中加入100 μL的Binding Buffer輕吹重懸 然后在每管中依次加入AnnexinV-FITC和PI各5 μL對細(xì)胞染色，避光反應(yīng)15 min后在每管加入400 μL的Binding Buffer，輕吹重懸后在1 h內(nèi)檢測流式細(xì)胞凋亡

1.3.4 細(xì)胞黏附能力的表征

使用ZEISS場發(fā)射掃描電子顯微鏡(HITACHI-3400N)觀察合金樣品上的細(xì)胞粘附能力 實(shí)驗(yàn)接種方法和樣品設(shè)置，與上述CCK8實(shí)驗(yàn)相同 在相同條件下將細(xì)胞接種在樣品表面，然后放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)168 h，到達(dá)時間點(diǎn)后棄去孔板內(nèi)的培養(yǎng)基并用PBS充分清洗 加入4%多聚甲醛使其沒過孔板內(nèi)樣品，然后將其置于4℃的冰箱中固定4 h 到時間后棄去多聚甲醛，再用PBS充分清洗 然后依次用濃度為30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇梯度脫水，每次10 min 最后用100%無水乙醇脫水5 min，重復(fù)一次 將其在陰涼處過夜風(fēng)干，噴金后用掃描電鏡觀察細(xì)胞粘附情況 所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次，取其結(jié)果的平均值

采用Graphpad prism 8和IBM SPSS Statistics 23分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，p<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義

2 結(jié)果和討論2.1 Ti-Zr-Cu合金的抗菌性能

金黃色葡萄球菌(S. aureus)和大腸桿菌(E. coli)分別屬于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，是有代表性的兩個常見菌種，也是引起骨科感染的常見細(xì)菌，因此常選用的菌種評價材料的抗菌性能 采用平板計數(shù)法檢測Ti-Zr-Cu合金對S. aureus和E. coli的抗菌率，以表征其抗菌性能 圖1給出了S. aureus和E. coli分別與Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金共培養(yǎng)24 h后的存活細(xì)菌菌落照片，可見空白(blank)對照組和Ti-Zr合金對照組的菌落密集，而Ti-Zr-Cu實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)極少 表3列出了各實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)和根據(jù)式(1)計算出的抗菌率，可見空白樣品和Ti-Zr合金沒有抗菌性能，而Ti-Zr-Cu合金對S. aureus和E. coli的抗菌率分別達(dá)到98.3％和97.7% 這表明Ti-Zr-Cu合金與空白樣品和Ti-Zr合金的差異(p＜0.01)顯著，意味著Ti-Zr-Cu合金對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有較高的抗菌性能

圖1



圖1金黃色葡萄球菌(S. aureus)和大腸桿菌(E. coli)分別與Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金共培養(yǎng)24 h后存活細(xì)菌菌落的照片

Fig.1Photos of colonies of S. aureus and E. coli after co-culture with Ti-Zr alloy and Ti-Zr-Cu alloy for 24 h (a) blank group (S. aureus); (b) Ti-Zr (S. aureus); (c) Ti-Zr-Cu (S. aureus); (d) blank group (E. coli); (e) Ti-Zr (E. coli); (f) Ti-Zr-Cu (E. coli)

Table 3

表3

表3不同材料對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的殺菌率(n=4)

Table 3Antibacterial rates of different materials against S. aureus and E. coli (n=4)

Group	S. aureus		E. coli
	Colony mean	Sterilizing rate	Colony mean	Sterilizing rate
Ti-Zr-Cu	5±4.99	(98.28±1.58)%	21±4.69	(97.67±0.49)%
Ti-Zr	294±16.44	—	900±12.96	—
blank	325±18.52	—	1087±43.60	—

Ti-Zr-Cu合金的抗菌性能，源于銅的殺菌作用 銅具有優(yōu)異的殺菌性能，屬于長效廣譜的殺菌劑，已經(jīng)作為一種固體無機(jī)抗菌材料注冊并列為醫(yī)用材料[20,21] 因此，銅的加入顯著抑制了細(xì)菌在Ti-Zr-Cu合金表面的粘附和增殖 研究表明[22]，當(dāng)細(xì)菌與含銅合金共培養(yǎng)時微量銅離子從合金中溶出，在濃度梯度驅(qū)動下從合金表面擴(kuò)散到細(xì)菌液中 銅離子通過電荷作用與帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面緊密結(jié)合，使細(xì)菌內(nèi)外膜電位失衡[23, 24]，從而破壞了細(xì)菌的細(xì)胞膜,導(dǎo)致細(xì)菌死亡 也有研究認(rèn)為，銅破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的原因，是銅離子通過芬頓反應(yīng)Cu++H2O2→Cu2++OH-+·OH[25]產(chǎn)生活性氧物種(ROS)，ROS抑制了細(xì)菌中的16SrRNA復(fù)制并使其死亡[26]

2.2 Ti-Zr-Cu合金的生物相容性2.2.1 Ti-Zr-Cu合金對貼壁細(xì)胞增殖的影響

圖2給出了CCK8細(xì)胞增殖的檢測結(jié)果 可以看出，培養(yǎng)24 h(1 d)后Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金的OD值都為0.2-0.4，培養(yǎng)96 h后增加到1.5，培養(yǎng)168 h后增加到2.8 由此可見，隨著培養(yǎng)時間的增加二種樣品的OD值逐漸增大 這表明，MC3T3-E1細(xì)胞在Ti-Zr和Ti-Zr-Cu合金表面都能良好地生長 第1天Ti-Zr合金組與Ti-Zr-Cu合金組的細(xì)胞增值差異非常顯著(p<0.01)，第4天和第7天的差異都不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05) MC3T3-E1在Ti-Zr-Cu合金表面1、4、7 d的相對增殖率分別為168.8%、109.8%和106.5%，均大于100%，表明這種合金沒有細(xì)胞毒性

圖2



圖2CCK8細(xì)胞增值檢測給出的MC3T3-E1細(xì)胞的 OD值(在450 nm處的吸光度)

Fig.2OD values of MC3T3-E1 cells measured by CCK-8 cell proliferation assay (absorbance at 450 nm)

銅是人體中必需的微量元素之一，是許多物理化學(xué)反應(yīng)和代謝所必需的元素，包括蛋白質(zhì)合成、酶和紅細(xì)胞的形成[27] 銅還具有多種生物功能，如刺激血管生成和成骨，以及抑制血栓形成，防止支架再狹窄、減小骨質(zhì)疏松[28]、抗菌和抗炎[29]等 但是，作為一種重金屬元素，過量的銅在體外有細(xì)胞毒性，在體內(nèi)可能會導(dǎo)致肝臟和神經(jīng)方面的疾病[30, 31] 因此，優(yōu)化含銅金屬的銅含量極為重要 世界衛(wèi)生組織建議成人每日銅攝入量上限為0.03 mg/kg[32] 銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.0141%的銅基合金溶出液，會產(chǎn)生較為明顯的細(xì)胞毒性[33] 文獻(xiàn)[34]的結(jié)果表明，Ti-Zr-Cu合金的銅釋放量約為0.047 mg/L/day，遠(yuǎn)小于上述標(biāo)準(zhǔn) 口腔內(nèi)種植體的體積很小，銅的釋放量遠(yuǎn)低于人體所能承受的每日最大攝入量 因此，Ti-Zr-Cu合金在人體中使用是安全的

2.2.2 Ti-Zr-Cu合金表面的細(xì)胞骨架形態(tài)

采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽和DAPI染色檢測細(xì)胞骨架形態(tài)，分別顯示出F-肌動蛋白(紅色)和細(xì)胞核(藍(lán)色)，如圖3所示 由圖3可見，培養(yǎng)24 h后Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金樣品表面的細(xì)胞形態(tài)沒有明顯的差異，均呈多邊形，沒有細(xì)胞溶解，細(xì)胞的形態(tài)完全伸展，偽足多且清晰，細(xì)胞核沒有明顯的改變，能清晰分辨細(xì)胞中的微絲微管結(jié)構(gòu)，細(xì)胞之間已建立了密切的網(wǎng)狀聯(lián)系 微絲之間良好的接觸和形成完整的網(wǎng)絡(luò)，是細(xì)胞進(jìn)一步增殖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[35] 細(xì)胞在Ti-Zr-Cu合金表面的附著和鋪展良好,有利于貼壁細(xì)胞在其表面黏附和進(jìn)一步增值，表明Ti-Zr-Cu合金具有良好的生物相容性

圖3



圖3MC3T3-E1細(xì)胞在Ti-Zr合金(a)和Ti-Zr-Cu合金(b)表面培養(yǎng)24 h后的羅丹明鬼筆環(huán)肽骨架染色

Fig.3Rhodamine phalloidin backbone staining of MC3T3-E1 cells on surfaces of Ti-Zr (a) and Ti-Zr-Cu (b) alloys after co-culture for 24 h

2.2.3 Ti-Zr-Cu合金表面的細(xì)胞凋亡

使用流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)72 h后Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金表面MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的情況，如圖4所示 圖4中左下象限(Q3)代表活細(xì)胞，右上象限(Q2)代表晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞，而右下象限(Q4)為早期凋亡細(xì)胞 圖4a、b收集到的主要是活細(xì)胞 對散點(diǎn)圖的統(tǒng)計分析結(jié)果在圖4c和4d中給出 圖4表明，Ti-Zr-Cu合金表面的細(xì)胞凋亡率為8%，Ti-Zr合金表面的細(xì)胞凋亡率為12.5% 使用spss和graphpad軟件分析p大于0.05，表明Ti-Zr-Cu合金對細(xì)胞凋亡沒有不良的影響

圖4



圖4MC3T3-E1 細(xì)胞在Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金表面培養(yǎng)72 h后的流式散點(diǎn)圖和柱狀圖統(tǒng)計分析

Fig.4Flow scatters and bar graph statistical analyses of MC3T3-E1 cells on Ti-Zr and Ti-Zr-Cu alloys after co-culture for 72 h (a) Ti-Zr alloy; (b) Ti-Zr-Cu alloy; (c) normal cell viability; (d) apotoic cell viability

細(xì)胞凋亡受到多基因的調(diào)控，其分子生物學(xué)機(jī)制復(fù)雜 調(diào)控凋亡的信號傳導(dǎo)通路，一是外源性途徑，又稱為死亡受體凋亡途徑；二是內(nèi)源性途徑，又稱為線粒體凋亡途徑[36] 外源性途徑是胞外信號通過細(xì)胞膜上死亡受體的介導(dǎo)傳入細(xì)胞進(jìn)而啟動凋亡[37] 內(nèi)源性途徑是非受體介導(dǎo)的刺激因子啟動細(xì)胞凋亡，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號作用于胞內(nèi)靶點(diǎn)，由線粒體發(fā)起凋亡[38] 銅的加入，沒有影響細(xì)胞凋亡，證明其并不影響細(xì)胞凋亡相關(guān)基因?qū)ζ涞蛲鲞^程的調(diào)控；也沒破壞細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)，表明Ti-Zr-Cu合金沒有細(xì)胞毒性

2.2.4 Ti-Zr-Cu合金表面的細(xì)胞黏附能力

使用掃描電子顯微鏡(SEM)表征Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金樣品的細(xì)胞粘附能力，圖5給出了培養(yǎng)72 h后樣品表面細(xì)胞的SEM照片 可以看出，細(xì)胞覆蓋了二種合金樣品的大部分表面，細(xì)胞的形態(tài)完整，偽足清晰纖長，有大量的絲足和片狀脂壁 細(xì)胞間通過絲狀足孔連接在一起，在樣品表面的鋪展表現(xiàn)出特定的方向性，且沿表面劃痕擴(kuò)散 這表明Ti-Zr-Cu合金表面有利于MC3T3-E1細(xì)胞的黏附和伸展 細(xì)胞在Ti-Zr-Cu合金表面的正常粘附，表明其具有良好的生物相容性

圖5



圖5MC3T3-E1細(xì)胞在Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金表面培養(yǎng)72 h后的掃描電鏡照片

Fig.5Images of scanning electron microscopy of MC3T3-E1 cells on surfaces of Ti-Zr (a) and Ti-Zr-Cu (b) alloys after co-culture for 72 h (200× and 1000×)

3 結(jié)論

Ti-Zr-Cu合金對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都具有優(yōu)異的抗菌功能，抗菌率分別高達(dá)98.3％和97.7% Ti-Zr-Cu合金的抗菌功能，源于在合金中添加了適量的銅 Ti-Zr-Cu合金的生物相容性良好，對成骨細(xì)胞無細(xì)胞毒性，滿足臨床應(yīng)用的要求

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