本發(fā)明涉及一種比率型熒光傳感器及其制備方法和應(yīng)用，屬于核酸酶檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。所述比率型熒光傳感器至少包括DNA四面體納米結(jié)構(gòu)，所述DNA四面體納米結(jié)構(gòu)由四條帶有熒光染料標(biāo)記的單鏈DNA自組裝形成。四色熒光探針由四種通過DNA四面體納米結(jié)構(gòu)連接的熒光染料組成，涉及多步熒光共振能量轉(zhuǎn)移。四色熒光探針可以被單一波長(zhǎng)激發(fā)并同時(shí)產(chǎn)生四個(gè)發(fā)射信號(hào)，并且可以清楚地區(qū)分多種核酸酶。將四條帶有熒光染料標(biāo)記的單鏈DNA混合后進(jìn)行退火反應(yīng)，然后進(jìn)行冷卻。這種四色熒光探針對(duì)于檢測(cè)物具有良好的選擇性，還可以用來篩選核酸酶抑制劑。此四色熒光探針經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾還可以具有多種核酸酶和核糖核酸酶的切割位點(diǎn)，使其在化學(xué)生物領(lǐng)域具有更廣應(yīng)用。