本發(fā)明公開(kāi)了一種含穩(wěn)定同位素的蛋白質(zhì)羧基磷酸化標(biāo)記試劑及其制備方法與應(yīng)用，所述蛋白質(zhì)羧基磷酸化標(biāo)記試劑為含氘?2、碳?13和氧?18等穩(wěn)定同位素標(biāo)記的有機(jī)磷試劑。所述標(biāo)記試劑的制備步驟為：(1)叔丁氧羰基保護(hù)的溴胺的制備；(2)叔丁氧羰基保護(hù)的含穩(wěn)定同位素的氨基膦酸酯的制備：(3)含穩(wěn)定同位素的氨基膦酸酯的制備。本發(fā)明所提供的標(biāo)記試劑可作為蛋白質(zhì)羧基磷酸化修飾標(biāo)記分子探針，對(duì)蛋白質(zhì)羧基磷酸化修飾位點(diǎn)特有的羧基磷酸混酐基團(tuán)進(jìn)行選擇性高效標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)具有不穩(wěn)定性的羧基磷酸化修飾到穩(wěn)定酰胺結(jié)構(gòu)的化學(xué)轉(zhuǎn)換，然后通過(guò)質(zhì)譜表征進(jìn)行定性和定量分析。本發(fā)明所提供的方法具有較好的準(zhǔn)確性、高靈敏度及廣泛的適用性等優(yōu)點(diǎn)。